硫酸锌添加对酿酒酵母乙酸胁迫条件下全局基因转录的影响
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  酿酒酵母广泛用于食品生产及酿造领域,也是生物乙醇生产广泛使用的微生物。选育具有良好发酵活性的酵母菌有利于提高生产效率,促进细胞循环使用,加强生产的经济性。但是,酿酒酵母在生长和发酵过程中,经常受到多种环境胁迫条件的影响,如木质纤维素水解
  酿酒酵母广泛用于食品生产及酿造领域,也是生物乙醇生产广泛使用的微生物。选育具有良好发酵活性的酵母菌有利于提高生产效率,促进细胞循环使用,加强生产的经济性。但是,酿酒酵母在生长和发酵过程中,经常受到多种环境胁迫条件的影响,如木质纤维素水解液中的抑制物(乙酸、糠醛、酚类物质等)、高温及高渗透压等,这些环境胁迫条件抑制酿酒酵母细胞生长及代谢,进一步影响乙醇生产效率。因此,酿酒酵母细胞对环境胁迫因素的反应和耐受性机制一直是国内外学者研究的重点[1-4]。在纤维素水解液抑制物中,乙酸含量普遍较高。在纤维素原料水解液中的浓度受所使用的生物质种类及预处理技术的影响而不同,但浓度大约在1?10 g/L[5]。因此,研究酿酒酵母乙酸耐受性对提高木质纤维素乙醇生产效率具有重要意义。
  乙酸的存在会延长酿酒酵母的发酵时间进而导致乙醇发酵效率的降低,对乙酸毒性分子机理的研究表明,高浓度乙酸会引起细胞内质子梯度的改变,造成能量枯竭[6];同时乙酸会引起细胞氧化胁迫,主要表现在胞内活性氧物质(ROS)的过量积累。过多活性氧导致细胞内DNA、蛋白质等损伤[7]。外源保护性物质的添加可以降低细胞内活性氧水平,提高酿酒酵母细胞对乙酸的耐受性。本课题组前期研究表明,发酵培养基中添加硫酸锌能提高酿酒酵母对乙酸耐受性[8]。本课题组前期研究还发现,在发酵液中添加硫酸锌能够降低细胞内ROS,提高发酵效率[9]。但是,锌离子提高酿酒酵母对乙酸耐受性的分子机制目前并不清楚。因此,本文比较了外源添加硫酸锌的条件下酿酒酵母细胞和没有添加硫酸锌的对照组细胞全局基因转录的差异,研究硫酸锌在乙酸存在条件下提高酿酒酵母乙酸耐性的分子机理。
  1 材料与方法
  1.1 菌种及培养基
  自絮凝酿酒酵母SPSC01,由本实验室保存。YPD液体培养基(g/L):葡萄糖20.0,酵母浸粉10.0,蛋白胨20.0。YPD固体培养基(g/L):YPD液体培养基中添加终浓度为20.0 g/L的琼脂粉。酵母菌种子培养基(g/L):葡萄糖30.0,酵母粉4.0,蛋白胨3.0。发酵培养基及培养条件见参考文献[8]。
  1.2 主要试剂和仪器
  提取RNA试剂盒、实时定量试剂盒,宝生物(大连)有限公司。韩国KoBio Tech KF-2.5L发酵罐,KoBio Tech Co. Ltd。
  1.3 种子活化和批次发酵
  实验方法参照文献[8],发酵罐pH控制恒定为4.5,每12 h取样一次,测定生物量、乙醇产量和残糖。实验重复3次,文中结果为3次的平均值。
  1.4 乙酸胁迫条件下硫酸锌添加转录组学测定
  培养实验组和对照组的酿酒酵母生长到对数中期,分别取4 mL菌液于8 000 r/min离心5 min收集菌体,用无菌水洗涤1次,在液氮中速冻10 min以上,?80 °C保存备用。转录组测定委托深圳华大基因。将提取的总RNA用带有Oligo (dT)的磁珠富集mRNA,并将mRNA打断成短片段,构建文库,使用Illumina HiSeqTM 2000测序仪进行测序。测序所得的数据经过滤得到Clean reads,比对得到参考序列酿酒酵母模式菌株S288c的基因组序列。比对结束后,进行基因和转录本定量分析、基于基因表达水平的各项分析,并对筛选出的样品间差异表达基因,进行GO功能显著性富集分析、Pathway显著性富集分析、聚类、蛋白互作网络和转录因子等更深入的挖掘分析。
  1.5 转录组变化的基因RT-qPCR验证
  采用TransGen Biotech试剂盒提取总RNA,经过TaKaRa PrimeScriptTM RT Reagent Kit试剂盒反转录为cDNA后,采用SYBR? Premix ExTaq? П (TliRNaseH Plus)试剂盒进行实时定量检测。实验中使用的引物序列见表1,选择ALG9作为内参[10]。实时定量PCR反应条件及相对定量方法见参考 文献[11]。
  2 结果与讨论
  2.1 锌离子对自絮凝酵母SPSC01乙酸胁迫耐受性的影响在10.0 g/L乙酸胁迫条件下,添加0.03 g/L硫酸锌能显著提高酿酒酵母SPSC01菌株的生长速率,并能明显提高生物量积累,结果见图1A。此外,添加硫酸锌的实验组细胞生长的延迟期缩短,添加硫酸锌的延滞期为12 h,比对照菌株的延滞期缩短12 h。本课题组前期研究发现,在15.0 g/L高浓度乙酸存在条件下,硫酸锌也能缩短SPSC01发酵的延滞期[8]。添加硫酸锌的实验组乙醇发酵时间缩短,也和前期研究结果一致[8]。但是目前对于硫酸锌对乙酸的保护作用机制还不清楚,目前有研究表明,锌离子可作为多个蛋白的辅助因子或结构的组成成分[12],可通过对多个蛋白的表达或活性的影响,影响酿酒酵母细胞全局代谢调控网络。为了研究硫酸锌对基因的影响,将乙酸胁迫下硫酸锌添加培养基中生长的细胞与不添加的对照进行转录组分析,比较二者的基因表达差异。